PCR引物设计的基本原则
引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
引物碱基:G C含量以40-60%为宜,G C太少扩增效果不佳,G C 过多易出现非特异条带。ATGC建议随机分布,避免5个以上的piao呤或嘧1啶核苷酸的成串排列参照。
引物内部不应出现互补序列。
两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要**过70%,
引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。引物3‘端的碱基,特别是zui末及倒数*二个碱基,应严格要求配对,zui佳选择是G和C。
引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点,基因分型PCR酶,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地1高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
污染的监测
一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
1、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。
2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括:
(1)标本对照:被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。
(2)试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。
3、重复性试验。
4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。
PCR法不仅仅局限于分子生物学,还因其简便、迅速等特点被广泛应用于医学、法医学、食品、环境卫生检验、动植物检验等其它领域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶,但其具有如下局限性。
1. 可信度 (Fidelity):通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高,PCR反应有时会出现错配 (Misincorporation) 现象,因而PCR克1隆、变异导入等实验中,需加以注意。
2. 扩增的DNA长度:使用Taq DNA Polymerase进行PCR扩增时,通常可扩增几kb的DNA,**过10 kb则比较困难。这就给利用PCR进行Mapping等Genome解析带来麻烦。
3. 扩增量:使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克1隆及食品、环境卫生检验等时,扩增量常常达不到要求。为解决以上难题,Takara在对Polymerase、Buffer及反应条件等进行深入研究的基础上,开发了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术,运用此技术可大量正确地扩增长达40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围,可在Genome解析、基因诊断、长片段 DNA的克1隆及变异导入等方面发挥优势。
基因分型PCR酶-友名生物公司由武汉友名生物技术有限公司提供。武汉友名生物技术有限公司为客户提供“商务服务”等业务,公司拥有“友名生物”等品牌,专注于其它等行业。,在湖北武汉市洪山区野芷湖西路16号创意天地办公04栋701的名声不错。欢迎来电垂询,联系人:董先生。
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